회사 특성상 대학원생들이 많은데, 대학원생들이 mRNA 추출하여 qPCR 돌리고 ∆∆Ct를 구하는 이유 및 하는 방법에 대해서 잘 모르는 경우가 많다. 이렇게 한다 정도만 가르쳐 주는 사람이 있기만 하더라도 좀 다행인데... 본인들 끼리 얼렁뚱땅 되어 버리는 일이 많아서 참고라도 해보시라고 이렇게 글을 적어본다. 힘내 애기들!
qPCR 하는 이유
qPCR은 RNA 발현양을 보기 위해 보통 실시한다. central dogma에서 DNA가 중요한게 아니라, RNA와 단백질이 더 중요하기 때문이다. 우리 몸에서 일을 하는 건 어차피 RNA고 단백질이기 때문이다.
조직이나 혈액에서 RNA를 뽑아서, 이를 Reverse transcriptase PCR, RT-PCR을 한 다음 cDNA로 만들어서 이를 qPCR 하는 것이다. 그렇다면 qPCR은 왜 쓸까?
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PCR의 정의와 기본 원리, PCR, rt-PCR, real time PCR, qPCR 차이점
PCR 이란? PCR의 역사 PCR 이란 Polymerase chain reaction의 줄임말로, 분자 생물학에 있어서 폭넓게 이용되고 있는 DNA 및 RNA 증폭 방법이다. PCR은 작은 분자량의 DNA 분절이 DNA primer에 의해서 여러 번 복제
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qPCR은 probe에 형광을 붙이고, 이걸 기계가 강도를 탐지함으로써, 내가 원하는 DNA가 얼마나 늘어났는지를 실시간으로 탐지하는 기계이다.
mRNA 뽑는 법
보통의 RNA extraction은 Quiagen의 키트를 사용하거나, Trizol을 사용한다. Trizol 방법이 수율이 높고, 키트 사용시에 순도가 높은 편이다. Quiagen RNA extraction kit 는 250 prep에 거의 300만 원쯤 한다. 그런데 Trizol에는 페놀이 들어있기 때문에 건강에 해롭다. 잘 판단해서 그때그때 적절한 것을 사용하는 것이 좋다.
Trizol 을 사용한 RNA extraction 원리와 protocol
Trizol은 Phenol계열의 시약이다. Phenol + Guanidine isothiocyanate + Chloroform 으로 이루어져 있고 Guanidine이 RNA분해 억제 역할을 한다. 그래서 보통은 진짜 생짜 Phenol+chloroform은 DNA분리에 사용하고, Trizol은 RNA분리에 사용한다. 즉각 세포를 분해하고 RNA는 용해가 되지 않도록 해주는 역할인 거다.
trizol 자체는 하나의 용액이지만, 여기에 chloroform을 넣으면 비극성 유기용매인 클로르폼이 극성 물질들(RNA)와 비극성 물질들 (지방, 단백질) 로 나뉘게 된다. DNA는 크기도 크고, 부분적으로 녹는데다, 지질에 잘 들러붙는 성질이 있어서 RNA보다는 아랫쪽에 위치하게 된다.
그래서 이런 모양이 되고, 우리는 이 투명한 상층만 사용하게 된다.
이 투명한 상층에 isopropanol을 떨어트린다. isopropanol은 유기용매라 극성을 떨어트리고, 물에 잘 녹는 극성 분자였던 RNA가 갑자기 극성이 떨어지면서 어? 못녹아~ 하고 고체로 응집하게 된다. 이걸 알코올로 씻어주고, RNAse free water에 녹여주면, 우리가 원하는 RNA가 완성된다.
Trizol 이용한 RNA 추출 프로토콜
*RNA는 개복치와 비슷하여, 될수 있으면 조심조심 시원하게... 덥지 않게...*
1. 시작전에 실험대 주변 RNase away로 한번 닦고, 될수 있으면 후드 안에서 실험한다. 장갑, 실험복 필수
2. 조직 용해시 100ug에 1ml의 Trizol, 세포 용해시 10^7 cell에 1ml의 Trizol을 사용한다. cell은 pipetting 하여 깨고, 조직은 homogenize 시키고 바로 ice에 담가둔다. (열발생)
3. 1ml의 Trizol당 200ul의 Chloroform을 넣는다. 피펫팅 여러번 해서 잘 섞어준다.
4. 13,000 rpm 4℃ 15min 원심분리한다.
5. 15min 동안 EP 튜브에 라벨링 하고, 500ul의 isopropanol을 분주한다.
6. 뺄때 흔들리지 않게 조심, 가장 윗쪽의 투명한 aqueous phase만을 따서 isopropanol이 들어있는 튜브에 넣는다. best는 동량인 500ul이지만, 적은건 상관 없고 많으면 1:1로 맞춰주는게 좋긴 함.
7. ice에서 30분 cool incubation, 혹은 냉동실에서 10분 cool incubation
8. 12,000rpm 4℃ 10min원심분리
9. 1ml을 딴다는 생각로 상층 액체 딴다. pellet 안보이는 경우 있으므로 천천히 딸 것
10. 70% EtOH in DEPC water, 제발!! 70% EtOH 만들때~~~ RNAse free water로 만드세요. 1ml 분주한다.
11. voltex 해서 pellet 한번 확인 하면 좋음
12. 8,000rpm 4℃ 10min 원심분리
13. 역시 1ml 딴다는 생각으로 상층액 버린다. centrifuge에서 top down 해서 100~200ul정도 더 딴다고 생각한다.
14. 뚜껑을 열고 EtOH만 날린다는 생각으로 잠깐 말린다. 진공 dryer등을 사용할수도 있지만 뜨끈뜨끈하게 바짝 말리는 건 좋지 않음. OD비율이 좀 높게 나와도 차라리 덜 말리는 게 낫다. Trizol 사용시에 260nm/280nm 비율은 1.8정도가 best, 2.0정도는 EtOH가 남아있기 때문임. 그래도 2.0까지는 OK
15. RNAse free water로 용해 시킨다. 나는 voltex하고 얼린뒤에 다시 녹여서 top down 시켜 OD값을 측정한다
16. OD값 측정하여 동일 농도로 희석한다 (희석액또한 RNAse free water)
qPCR 돌리는 법, qPCR 사이버그린? 택맨?
이제 키트를 사용해서 RT-PCR을 한다. RT-PCR의 primer는 random-hexamer 혹은 oligo DT를 사용한다. 둘이 차이점이 있다고는 하는데, 보통 one step kit로 나오는 제품들은 두개가 다 섞여져 있다.
RT가 끝나면 qPCR을 한다. qPCR은 크게 두개 중 하나로 쓴다. 사이버그린 SYBR과 택맨프루브이다. TaqMan probe! 간단하게 이야기 하자면, SYBR이 싸고, Taqman이 비싸다. 그 말인즉슨, Taqman이 좀 더 specific하게 반응한다는 것이다. 사이버그린은 비특이적으로 이중가닥 DNA에는 무조건 형광을 방출한다. PCR 할 때 primer를 많이 넣으면 dimer를 형성하게 되는데, 이 dimer에도 사이버그린은 반응하는 등의 단점이 있다.그래서 사이버그린으로 qPCR을 하면 무조건 melting curve를 그리게 한다.
Taqman probe의 경우에는 형광이 붙은 probe를 탐지하는 형식이다. 이게 무슨 말이냐면, 주문을 다 따로 넣어야 한다는 말이다. 만약에 내가 어떤 유전자를 보고싶은데 (GAPDH) 이 유전자의 probe를 제작해야 한다. 만약에 내가 GAPDH를 녹색 형광으로 제작했다고 하고, 타겟 유전자를 빨강으로 제작했다고 하면, 한 well에서 녹색 형광과 빨강색 형광 두개가 나오고, 이를 정량할수 있다는 말이다. multiflex qPCR에 최적화 되어 있고, SYBR로 했으면 GAPDH와 타겟유전자 두번 실험 할 거, Taqman으로 하면 한번에 가능하니 편리하다. 실험실에 있는 qPCR기계의 값은 몇가지의 형광 파장을 detection할수 있느냐고 결정된다. 참고로 우리 실험실에 있는건 4channel인데 3천만원 정도 한다. 참고로 십수년전에 샀는데도 그렇다. 색상이 다양해질수록 기기값이 올라간다.
유전자마다 형광이 붙어있는 probe를 따로 만들어서 써야하니 유전자에 대한 특이도는 높지만, 비싸고 소모적이고 공간차지가 크다. 그래서 보통 mRNA를 탐지하는 실험은 스크리닝 개념이 크기 때문에 SYBR을 많이 사용한다. 빠르게 계속해서 어떤 하나, 또는 여러개의 유전자를 보기 위해선 택맨이 좀 더 적합하다. 요즘은 병원에서 특정 유전자 발현을 토대로 항암제를 처방하기 때문에, 여러 taqman probe를 붙여 보기도 한다. 제일 흔한 건 아무래도 COVID-19 검사이다.
qPCR 결과 값 계산하는 법.
qPCR을 돌리고 나면 2^-∆∆Ct를 계산한다. 이게 무슨 뜻이냐면, DNA가 증폭하는 포인트인 Ct 값을 토대로 내 샘플의 RNA가 얼마나 들었는지 비교하겠다는 이야기다. 이 것을 계산하기 위해선 house keeping gene이 필요하다. house keeping gene이란, 항상 일정하게 발현되고 있는 유전자를 의미한다. 어디에서나 일정하니까, 얘를 기준으로 해서 계산을 하겠다는 뜻이다. House keeping gene에는 우리가 잘 알고 있는 GAPDH나 β-actin이 있다. 내가 RNA를 많이 넣으면 Ct값이 적어지고(빨리 증폭되고) RNA를 적게 넣으면 Ct값이 늘어나는데 (늦게 증폭되고) 그걸 이제 보정하기 위함이다.
2^-∆∆Ct란, Ct값의 차이를 한번 ∆, 두번 ∆ 구한 뒤, 이 값은 log2값으로 변환하여 양수 음수 값을 구하게 된다. ∆∆Ct 값을 구하면 이 값은 무조건 양수가 되는데, 정규분포도를 그리기 위해서 음수값으로 표현하기 위함이다. 모르면 걍 넘어가도 됨,. 어쨌든 처음의 ∆Ct는 기준 House keeping gene과 내 target 유전자의 발현량 차이다. ΔCt = Ct(타겟 유전자) - Ct(내부 기준 유전자)
- 타겟 유전자 Ct = 24
- GAPDH Ct = 20
- ΔCt = 24 - 20 = 4
두번째 ∆∆Ct는 ∆Ct값과 내가 기준으로 삼고자 하는 target진의 차이이다. (Housekeeping gene하고만 비교했지, 내가 원하는 대조군과 대조를 못해봤기 때문에 한번더 대조를 해보는 것) ΔΔCt = ΔCt(실험군) - ΔCt(대조군)
- 실험군 ΔCt = 4
- 대조군 ΔCt = 2
- ΔΔCt = 4 - 2 = 2
이제 log2값을 넣어보면된다. 아까 ΔΔCt = 2 였으므로 2^-2=0.25가 된다. 그렇다면 실험군의 발현 비율이 대조군에 비해 25%정도 밖에 되지 않는다는 뜻이다.
Ct값 계산 파일을 하나 올려두시 유용하게 쓰시길!
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