PCR의 정의와 기본 원리, PCR, rt-PCR, real time PCR, qPCR 차이점

 

PCR 이란? PCR의 역사

PCR 이란 Polymerase chain reaction의 줄임말로, 분자 생물학에 있어서 폭넓게 이용되고 있는 DNA 및 RNA 증폭 방법이다. PCR은 작은 분자량의 DNA 분절이 DNA primer에 의해서 여러 번 복제되어 증폭되는 것이다. PCR의 기본원리를 이해하기 위해선 DNA 이중나선의 구조를 알아야 한다. 

DNA는 상보 염기들이 결합한 이중나선의 구조를 띤다. 이런 DNA가 복제될 때는 DNA Helicase에 의해서 이중 가닥이 분리되고, 단일가닥의 DNA에 DNA Polymerase가 붙어 새로운 DNA 이중나선을 만들어낸다. 

DNA 복제 영상 확인

이러한 DNA의 복제 과정은 모든 생명체에게서 일어난다. 캐리 멀리스 Kary Banks Mullis라는 생화학자가 1984년, 이러한 DNA의 특성을 이용하여 PCR을 하는 방법을 고안했다.

 

뜨거운 고열을 이용하여 DNA 이중나선을 분리하여 단일가닥으로 만든 뒤에, (Denaturation, 변성)

내가 원하는 염기서열을 증폭할 수 있는 primer를 붙여서(Annealing, 결합) DNA를 복제한다.(Elongation, 신장)

이러한 과정을 보통은 35번에서 40번 정도 반복하여 내가 원하는 DNA 염기서열을 본래의 양보다 2의 35 제곱에서 40 제곱 많이 얻을 수 있다.

 

그런데 여기에서 문제점이 발생했다. 생체내에서 안정적으로 존재하는 DNA 이중나선을 단일가닥으로 분리하기 위해선 뜨거운 열이 필요했다. 고열로 DNA 가닥을 분리하고 온도를 내려서 primer을 결합시킨 뒤 DNA를 복제하고 다시 고열로 DNA 가닥을 분리하면 앞서 넣었던 효소인 primer가 변성되어 primer를 또 넣어주어야 했다.

 

이러한 불편을 해결하기 위한 방법은 1988년, 온천수에서 살아가는 고세균의 일종인 Thermophilus aquaticus 가 발견되면서 세상에 나오게 되었다. 

Thermophilus aquaticus

 이 세균은 섭씨 65도에서 70도에서 가장 잘 자라는 세균으로, 이 세균 안에 존재하는 DNA Polymerase는 뜨거운 고온에서도 변성이 되지 않는 것이 발견되었기 때문이다. Thermophilus aquaticus의 DNA polymerase, Taq primer를 사용하여 PCR를 실시한 논문이 발표되었고, 그 이후부터 PCR은 폭넓게 사용되는 기술 중의 하나가 되었다.

 

PCR과정

앞서 설명한 것처럼 PCR은 크게 세가지 과정을 거친다.

1. Denaturation, 변성: 뜨거운 고온을 가해서 DNA 이중가닥을 단일가닥으로 분리하는 과정이다. 

2. Annealing, 결합: 내가 가진 primer가 상보적인 DNA 염기서열에 결합하는 과정이다. 이때, G, C 염기는 수소결합이 세 쌍으로 결합하기 위한 에너지가 A, T염기보다 더 필요하다. 따라서 Annealing 할 때의 반응 온도는 G, C의 구성에 따라 달라진다.

3. Elongation, 신장: 결합된 primer에 의해서 DNA가 복제되는 과정이다.

PCR 과정 애니메이션

 

PCR종류

AbeginnersguidetoRT-PCRqPCRandRT-qPCR.pdf

1.33MB

①RT-PCR

Reverse transcription PCR, RT-PCR,  역전사중합효소 연쇄반응: RT-PCR은 RNA를 cDNA로 바꾸어서 이를 증폭하는 실험방법이다. 이전에는 RNA 검출을 위해 Northen blot을 많이 사용했다. 이는 southern blot과 유사한 방법으로 아가로스 겔을 이용하여 RNA를 정량적으로 분리하는 방법이다. 하지만 노던 블롯은 시간이 많이 걸리고, 양질의 RNA를 뽑기 위한 숙련된 기술이 필요하다는 단점이 있었다. 

Northen blot 원리

이러한 단점을 보완하기 위한 방법이 RT-PCR이다. RT-PCR은 Retrovirus가 가지고 있는 역전사효소 (RNA dependent DNA polymerase, Reverse transcriptase)를 이용하여 분리한 RNA에서 cDNA를 합성하여 이를 증폭시키는 방법이다.

 

그렇다면 왜 굳이 RNA를 탐지해야 하는 걸까? 어차피 RNA는 DNA에서 나오는 건데 말이다. 내가 원하는 단백질을 coding하고 있는 DNA를 조사하면 되는 일 아닌가? 여기에는 큰 의미가 있다. DNA에서 protein으로 가는 central dogma 과정 중에서 많은 editing이 일어난다는 점이다. 따라서 이는 정제된 유전 산물인 RNA나 단백질을 연구할 필요가 있음을 의미한다. 또한, RNA를 유전인자로 가지고 있는 바이러스에 대한 연구를 할 때에도 RNA 탐지 과정은 필요하다. 최근 3년간 전 세계를 휩쓴 COVID-19또한 RNA 바이러스 이므로, 이를 탐지하기 위한 PCR검사는 RT-PCR을 이용한다. 

 

RT-PCR 개요

②real-time PCR

실시간 중합효소연쇄반응, qPCR, Real-time PCR: qPCR이라고 알려진 real-time PCR (real-time PCR과 RT-PCR은 엄연히 다른 검사 방법이다. 혼동하여 쓰지 않도록 주의한다.)은 PCR산물을 아가로스 겔에 전기영동을 하지 않더라도 정량적으로 검사할 수 있는 방법이다. 이 방법은 DNA의 증폭과 정량을 동시에 수행하며, DNA에 형광 probe를 붙여 내가 원하는 유전자가 얼마나 증폭되었는지 알아내는 방법이다. 

 

이 방법은 특정 유전자의 발현량을 알아내고자 할 때 쓰이기도 한다. SNP (Single nucleotide Polymorphism) 검사를 할 때에도 쓰인다. SNP란 단일 염기 다형성의 줄임말로, C,G,A,T의 염기서열 중 하나가 달라져 다양한 표현형이 나오는 것을 유전형질 분석(Genotyping)이라고 한다. 이러한 Genotyping은 최근 질병 발현과 맞춤 약물 개발에 중요한 플랫폼을 제공하고 있으며, 이러한 단일 염기 서열의 다양한 변화를 알기 위하여 real time PCR을 사용하고 있다.

real-time PCR 애니메이션

 

qPCR 개요

③RT-qPCR

실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 RT-real time PCR: 이 반응은 1번의 RT-PCR과 2번의 real-time PCR이 결합된 형태이다. RNA를 주형으로 하여 cDNA를 만들고, 이 cDNA를 증폭시키며 동시에 정량적으로 발현량을 측정하는 방법이다. 이 방법이 최근 COVID-19 진단 검사에 사용되고 있다.

RT-qPCR 애니매이션(코로나바이러스 진단)

④nested PCR

nested PCR : 이 PCR기법은 여러쌍의 프라이머를 이용하여 내가 원하고자 하는 타겐 유전자를 검출하는 방법이다. 염기서열로 구성된 프라이머의 특성상 원치않은 dimer가 형성될 수 있는데, 이를 방지하고자 primer를 두쌍 준비하여 내가 원하는 염기서열만이 복제되도록 nest(그물망)을 치는 형식이다.