FELASA 미생물 모니터링 가이드

FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig, and rabbit colonies in breeding and experimental units

2014, FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits

 

Abstract

 

실험동물의 미생물학적인 quality가 동물복지와 연구의 타당성, 연구 데이터의 재생산성에 치명적인 영향을 끼칠 수 있다. 따라서 사육 및 연구 시설은 실험동물의 health monitoring 프로그램을 모든 품질 보증시스템의 통합된 부분으로 설정하는 것이 중요하다. FELASA에선 설치류와 토끼의 HM에 대한 추천사항을 발간한바 있다. 이런 추천사항은 실험 동물 의학의 발전에 맞춰 정기적으로 수정되어야 한다. 이번 권고안은 mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit을 사용하는 진단 실험실 뿐 만 아니라 모든 사육자와 사용자를 대상으로 한다. 이 권고안은 HM의 필수적인 요소들, 예를들면 agent의 선택, 동물과 조직선택, 샘플링주기, 주요 테스트 방법, 결과 해석 및 HM reporting 과 같은 것이 서술된다.

 

환경과 유전요소, 이들의 상호작용에 의해 동물이 연구에 사용되어도 적합한지에 영향을 미칠 수 있다. 연구에서 생물학적 특성이 알려진 동물의 사용은 실험결과를 재현하는데 중요하다.

대부분의 감염은 명백한 임상징후로 이어지지 않는다. 따라서 질병증상이 없다는 것은 진단가치가 제한적이라는 것 뿐이다. 하지만 잠복, 불현성 감염은 동물 실험 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 현성이든 불현성이든 간에 감염은 과학적인 결과를 혼동시키고, 생물학적 및 실험적인 변동성을 증가시키며, 동물 사용의 증가를 야기할 수 있다.

이식종양이나 조직, cell line, 혈청, 배아, 생식샘과 같은 생물학적인 product의 오염은 동물의 불현성 감염에 의해 발생할 수 있다. 이런 오염은 새로운 동물을 감염시키거나, 물질 사용을 방해할 수 있다. 또한 일부 병원체는 인간을 감염시킬 수 있다.

이런이유로, 각 기관이 모든 품질 보증 시스템에 통합시켜 실험 동물의 HM 프로그램을 설정하는 것이 중요하다. 

 

동물에게 동물의 model이나 실험 프로젝트를 방해할만한 agent가 없는 것은 중요하다. 하지만 모든 미생물이 없는 것은 권고사항이 아니라는 것 또한 강조되어야 한다.

 

HM은 복잡한 문제이다. 따라서 HM의 원칙을 충분히 이해하고 있는 사람이 HM의 유지와 운영에 책임을 가지고 있어야 한다. 또한 HM의 성공적인 운영은 직접 동물과 접촉하는 작업자 (care staff, 테크니션, 연구자) 혹은 간접접촉하는 작업자(공급팀)도 HM에 대해서 이해하고 있어야 한다.

 

General considerations in the design of an HM programme

 

현재 권고안은 실험 동물중 설치류와 토끼의 HM에 대한 공통 접근 방식과 결과 보고를 구성한다. 상대적으로 흔치않은 gerbil이나 chinese hamster는 다루어지지 않는다. 권고안은 개인 및 지역적요구, 연구목표, 특정 agent의 지역적분포, 국가 관리 계획의 존재, 혈청 및 백신 생산과 관련된 규정과 같은 것들에 맞게 수정되어야 한다.

하지만 미생물 상태에 대한 표준은 명확해야 하며, 표준 충족을 위한 예방조치를 실시해야 한다. 각 동물 사육 시설에 수립된 문서화된 HM프로그램은 예방조치가 효과적이었는지, 미생물 품질 목표가 달성되었는지 여부를 결정해야 한다.

동물시설은 미생물학적인 'unit'으로 구성된다. 이런 단위는 미생물학적 독립체로 정의되는데, unit별로는 별도의 공간과 이동경로를 가지게 된다, HM 프로그램 설계 책임자는 유닛을 정의하고, HM 계획을 세우는 역할을 맡는다. 동일 시설에서 unit에 따라 다른 모니터링 프로그램이 필요할 수 있다. 유닛의 설정은 sampling 프로그램, 시험의 성격과 빈도, 결과에 영향을 미치기 때문에 중요하다.

 

breeding 시설에서는 소수의 사람만이 출입할 수 있어야한다. 드물게 동물이 도입되는 경우가 있더라도, 엄격한 검수 절차를 거쳐야 한다. 군 내에 많은 동물의 분포가 가능한 점을 감안하며, 모니터링의 빈도와 철저함이 감염물질 확산 방지에 필수적이다.

실험시설에선 사육과 실험이 모두 이루어진다. 외부로부터의 동물 유입또한 일어날 수 있다. care taker 외에도 많은 연구자들이 시설에 출입하며, 실험에 사용되는 생물학적 material 또한 모니터링 대상이 되어야 한다.

IVC 사용이 이제는 일반적인데, open cage에 비해서 fomite나 감염 물질 전달이 감소한다. IVC 사용은 알러젠이나 감염물질의 전달을 감소시키기 때문에, HM을 실시하면서 적절한 샘플링을 하는 것이 중요해졌다.

새로운 전염병과 HM기술도 고려대상이다. 새로운 agent나 새로운 탐지기법들은 HM프로그램의 목표는 변경하지 않으며, 모니터링 수단이나 report되는 내용만을 변경할 뿐이다. 만약에 프로그램에 포함되어 있진 않지만, 병원체로 여겨지는 경우에는 열거된 agent 처럼 처리되어야 한다.

 

프로그램의 설계는 필요에 맞게 조정되어야 하며, 유닛, 동물의 종, 면역상태, 단위내 개체수, 모니터링 빈도, 실험할 organism, 검출방법, 이력등을 고려해야한다. 유닛내에 두가지 이상의 동물종이 사육된다면, 각 종을 따로 선별해야 한다. 

더해서 감염에 대한 민감성과 혈청학적 반응은 연령과 유전배경에 따라 달라질 수 있으므로 다양한 연령대의 동물이 모니터링을 위해 선택되어야 한다. strain이나 stock이 다양할 경우 가능한 많은, 혹은 모든 종류들이 검사되어야 하며 불가능한경우 rotation을 통해 표본이 골고루 선발 될 수 있도록 한다.

 

Choice of agents

모니터링 할 물질의 선택은 동물 건강에 대한 영향, 연구에 대한 영향, 종특이성, 인수공통질병 잠재성,유병률, 숙주의 요인(면역상태등) 등의 수많은 요인에 의해 결정된다. 하지만, 유기체의 발견이 반드시 이가 제거되어야 한다는 것을 의미하진 않는다.

 

모니터링되는 항목은 영구적이지 않다. 시간이 지나면서 바뀌며 이를 잘 관찰해야만 한다.

 

species specifity and zoonoses

어떤 미생물은 숙주에 특화되거나, 숙주 범위가 한정되어 있는 반면, 어떤 미생물은 다른 종을 감염시킬수도 있다. 이는 사람에게 옮겨질 수 있음을 의미하며, 사람에 의해 동물에게 옮겨질 수 있음도 의미하고 있다. 생물학적 product를 사용하면서도 zoonosis의 감염 위험은 존재하기 때문에, 동물에게서 사용하기 위한 인간의 cell line은 설치류와 인간 병원균 모두에 대해서 검사가 이루어져야 한다.

opportunistic and emerging agents

면역이 competent한 동물에게서 임상 징후를 일으키지 않는 다양한 미생물은 면역 결핍 동물이나 다른 질병, 실험 절차 또는 약물에 의해 면역력이 약해진 동물에게서 질병을 일으킬 수 있다. 유전자 조작이 된 동물의 경우 또한 마찬가지이다. 예상하지 못한 표현형이 나타날 수 있기 때문이다. 거의 모든 미생물들이 이런 동물에게 기회감염을 일으킬 수 있다. 따라서 이를 다 모니터링 한다는 것은 불가능 하며, 병생성은 숙주, 미생물, 환경 또는 이들의 조합을 포함하여 다양한 요인을 고려해야 할 것이다.

prevalence of infectious agents

널리 사용되는 제제는 그렇지 않은 제제들 보다 오염의 위험이 더 높다. 유병률은 동물이나 생물학적 product의 본직적 특성 뿐 만 아니라, 진단도구, 예방 및 치료 방법의 개발 및 적용에 따라 달라질 것이다. 

biological materials

생물학적인 product는 잠재적으로 세포내 미생물을 포함할 수 있다. 배아 줄기세포는 MHV에 지속 감염되기 쉬우며 virus를 생산하기도 한다. 미생물은 단클론 항체들을 통해서도 전염된다. 최근에는 그 빈도가 줄어들었다고 하지만, 위험성은 항상 존재한다.

 

Animals for testing and sampling

정확한 HM 프로그램의 결과를 위해서 테스트할 동물과 sample의 선택이 중요하다. unit내 상주하는 (resident) 동물이 가장 믿을만 한 정보를 제공한다. unit이 두개 이상의 방으로 구성된 경우 가능한 한 많은 방에서 샘플링을 실시해야 한다. IVC또한 마찬가지로 가능한 많은 케이지에서 샘플링 되어야 한다. 

정기 모니터링을 위해 예정된 동물 내에도 병들거나 죽은 동물, 이런 동물로부터 취해진 샘플들이 검사를 위해 제공되어야 한다. 이를 통해 폐사와 질병의 원인이 실험때문인지, 감염때문인지를 알 수 있다. 부검의 결과는 sample size나 부검의 빈도를 증가시키거나 추가적인 screening으로 이어질 수 있다.

 

resident animals

same strain 이나 stock을 적어도 100마리 이상 사육하는 convention 환경의 open cage의 경우, ILAR 공식을 이용하여 표본의 크기를 추출 할 수 있다. 각 agent 별로 감수성의 차이가 있기 때문에, 모든 연령과 두 성별 모두가 샘플링 되어야 한다. 동물들은 unit 내의 다른 장소와 cage에서 선출 되어야 한다. ILAR 공식은 특정경우에만 사용될 수 있다. 예를들면, 감염이 확산되어 자유롭게 분포될 수 있는 최소 100마리 이상의 동물이 있을 경우 등이다. Isolator나 IVE의 경우 사용하기 적합하지 않다.

sentinel animals

일부 실험 및 사육 단위에서는 주거조건, 상주 동물이 면역 결핍인 경우, 동물의 부족과 같은 여러 ㅇ인에 의해 상주동물의 직접 샘플링을 허용하지 않을 수 있다. 따라서 HM이 sentinel animal에 의해 수행될 수 있다. sentinel은 미생물학적 상태를 평가하기 위해 같은 종 (혹은 다른 종)의 동물에 노출되며 충분한 노출 기간이 필요하다. sentinel 동물은 주로 외부로 부터 도입되지만, 상주동물에게서 취한 뒤에 다른 상주동물에게 노출하는 식으로도 실시할 수 있다. sentinel이 unit내에서 취해지지 않는경우, 감시대상 agent와 이에대한 항체가 없는 모집단으로 부터 구해야 한다. 

sentinel은 간접, 직접적으로 수행될 수 있다 sentinel은 상주동물과 같은 유닛에 최소 6주 이상 수용되어야 한다. Mycoplasma pulmonis, pasteurella pneumotropica와 같은 특정 agent는 더 긴 노출기간(10~12주)이 좋다. 또한 유병률이 낮은 경우에도 sentinel animal을 더 오랫동안 유지해야 한다.

일반적으로 sentinel animal은 조사대상과 동일한 동물 종이어야 한다. 때때로 exotic한 종이 실험실에 유입되는 경우가 있는데, 이 때는 일반적인 설치류가 sentinel로 이용되며 이는 exotic animal이 common 설치류에게 감염시키는 요인들에 대해 알 수 있다.

다양한 strain 과 stock의 동물이 효과적으로 sentinel로 사용될 수 있다. 면역 competent한 outbred mouse가 자주 선택된다. Inbred 나 mutant 의 경우 특정 감염원에 감수성이 달라 이를 고려해야 한다. 유사하게 동물의 성별이나 나이 또한 영향을 미칠 수 있다. 혈청학 적으로 검사할 경우, sentinael animal은 immunocompetent 한 어린 동물이어야 한다. 면역 부전 동물들은 면역이 competent한 동물들 보다 감염체에 민감하나, 혈청학적으로 이를 탐지하기 어렵다.

Pneumocystis murina나 Corynebacterium bovis와 같은 병원체는 지속감염 될 수도 있으며 면역이 온전한 sentinel에게선 감염후 사라지기 때문에, 직접 면역부전동물로부터 검출해야 한다. 면역결핍 동물의 단점은 그들이 다른 상주하는 동물들에게 지속감염의 원천이 될 수 있다는 점이다.

sentinel 동물은 상주군과 직접, 또는 간접 접촉하여 감염 물질을 획득할 수 있다. 가장 흔한 간접접촉 방식은 dirty bedding을 이용한 것이다. 이를 위해서는 적절한 수의 케이지에서 bedding이 채취되어야 한다. dirty bedding sentinel은 적어도 반 이상의 dirty bedding을 포함한 cage에 수용되어야 하며, bedding은 적어도 매주 교체 되어야 한다. HM programm의 책임자에 의해 각sentinel cage에 공급되는 cage수가 정해진다. 일반적으로 50~80개의 IVC에 1개의 sentinel이 사용된다. bedding 공급 케이지를 바꿔주는 것이 미생물적 상태를 파악하는데 도움이 된다. 이 방법에 대한 신뢰성은 sentinel의 선택, 감염경로, 감염 기간, 배추뢴 감염원의 농도, 배출된 후 감염원의 안정성, 감염원이 얼마나 bedding에 존재하는지, bedding을 얼마나 자주 옮기는지에 따라 달라진다. sentinel animal에게 또한 상주동물이 먹던 사료나 사용했던 음수를 먹게 함으로써 sentinel이 이루어질 수 있다. sentinel animal은 맨 마지막에 다루어야만 한다.

모든 agent가 bedding을 통해 쉽게 전파 되거나 배기 공기를 통해 전염되는 것은 아니기 때문에 직접 같은 케이지에 놔두어 직접 접촉이 이루어지게 한다. 직접 접촉 sentinel을 이용하면 이러한 요소를 탐지할 가능성을 더 높여준다. 

 

ssays and interpretation

모니터링의 결과는 수의학, 의학, 미생물학 학사 학위를 소지한 직원의 감독하에 수행되어야 한다. 또한 각 동물시설은 HM의 원리를 충분히 이해하고 있는 사람을 실험 결과 해석을 위한 책임자로 선정해야 한다. 실험 결과가 항상 충분한 것은 아니며, 양성 음성 결과를 해석하기 위해 추가적인 정보가 필요할 수 있다.

집단내 감염원의 존재는 다양한 직, 간접적 방법을 통해 탐지 가능하다. 동물의 부검을 통해 사체의 이상여부를 체계적으로 검사하고, 심각한 이상이 있다면 장기를 검사한다. 정상적인 장기에 대한 조직병리학적 검사는 일반적으로 필요하진 않다.

동물의 피부와 털은 외부기생충의 증거를 조사해야 한다. 기생충의 식별은 종의 이름까지 가능한 한 진행되어야 한다.

혈청학적인 방법은 바이러스 스크리닝에 널리 이용되며, 특정 박테리아나 Encephalotozoon cuniculi와 같은 병원체를 탐지하는데 이용된다. 적절한 혈청학적 진단법에는 MFI, ELISA, IFA, HAI 등이 포함된다. western blot은 일반적이진 않지만 매우 민감도와 특이도가 높다. 따라서 확인을 위해서 가끔 사용된다.

PCR검사는 양성 또는 모호한 혈청학적 결과의 확인, 혈청의 conversion이 일어나기 전의 조기검출, 면역 결핍 동물 검사에 유용하다. 시료에 대상 agent가 시험시에 존재해야 하기 때문에 평가를 위한 동물과 조직을 주의깊게 선택해야 한다. PCR은 동물로 부터 agent가 전달될 위험을 평가하는데에도 사용될 수 있다. 더해서 PCR은 생물학적 product를 검사하는데 중요하게 사용된다.

배양기법은 보통 대부분의 박테리아와 진균을 검출하기 위해 사용된다. 일반적으로 샘플은 생식기 점막, 대장, 비인두, 기관에서 채취될 수 있다. 다른곳에서도 채취 가능한데, 특히 세균의 origin으로 의심되는 병변 또한 배양되어야 한다. 토끼와 기니피그의 피부가 dermatophyte 검사에 이용될 수 있다. 필요하다면 세균의 식별은 종수준으로 진행되어야 한다.일반적인 의학적, 수의학적 키트는 실험동물에게서 박테리아를 정확하게 분리해내지 못할 수 있다. PCR은 현재 routine하게 일부 박테리아, 특히 헬리코박터 spp 검출과 식별에 이용되고 있다. 헬리코박터 spp는 배양이 어렵기 때문이다. 다양한 박테리아를 검출하기 위한 혈청학적인 방법이 존재하지만, 박테리아의 항원구조는 복잡하기 때문에 바이러스와 비교했을 때 위양성의 위험이 더 높다.

적합한 시험 방법을 사용한다고 해서 반드시 신뢰할 수 있는 시험결과를 나타내는 것은 아니다. 신뢰성은 시험의 민감도와 특이도 뿐 만 아니라 샘플이 unit을 대표하는지가 중요하다. 양성의 결과는 동물을 도태하거나 시설소독, 실험중단 등 극단적인 결과를 초래할 수 있으므로 구체적인 다른 방법을 사용하여 양성결과를 확인하는 것이 중요하다. 결과는 resident 동물이나 sentinel 의 반복적인 샘플링과 테스트를 통해 확인되어야 한다. 다른곳에서 실험할 경우 결과가 달리 나올 수 있기 때문에 가능하다면 다른 실험시설에서도 확인해야 한다. 

헷갈리거나 경계선상의 결과들은 명확한 결과가 나올 때 까지 추가로 조사해야 한다. 잠재적인 오염물질 확산을 방지하기 위해 확인을 기다리는 동안 HM 계획을 수립해야 한다. 진행중인 확인 절하는 report에 기재되어야 한다. 

모든 검사에서 위양성, 위음성 결과가 나올 수 있다. 이럴 때 유병률 데이터는 시험결과의 예측에 도움이 될 수 있다. 잘 검출이 안되는 agent들은 양성으로 확인되는 경우 또한 적을것이다. 다수의 혈청으로 검사를 한 경우 테스트의 특이도가 높더라도 위양성 결과가 나타날 수 있다. 동물의 혈청에 항체가 나타난다는 것은 일반적으로 현재, 또는 이전의 감염을 나타내지만, 모체이행항체, 예방접종, 교차반응에 의해서도 나타날 수 있다. PCR 또한 샘플이 오염되거나 DNA의 비특이적 증폭에 의해 위양성 결과가 나올 수 있다.

혈청검사를 사용할 경우 음성결과는 모니터링에 사용되는 동물에게 항체 화동이 아직 검출되지 않았다는 것 밖에 입증하지 못한다. 따라서 음성 결과가 unit내의 모든 동물의 상태를 결정하는 것은 아니다. 동물이 항체 반응을 생성하는데는 며칠 또는 몇 주가 걸리기 때문에 감염 초기에는 혈청검사 결과가 음성일 것이다.

파보바이러스와 같은 일부 보편적인 agnet에 감염된 설치류에 대한 연구에서 일부 감염된 동물에게선 seroconvert가 느리거나 나타나지 않았다. seroconversion은 용량, 생물학적 속성, 감염된 동물의 유전적 구성, 나이, 면역 상태에 따라 천천히 또는 일어나지 않을 수 도 있다. 따라서 헷갈리는 결과가 나왔을 경우, 이를 신중하게 파악해야 한다. PCR결과 또한 위음성으로 나올 수 있다. 불현성 감염을 일으키는 세균은 적은 수만 존재하기 때문에 탐지가 잘 안될 수 있을 뿐더러 보통배지에서 일반균이 너무 빨리 자라거나 이동중에 사멸해서 검출이 안 될 수 있다. 최근에 사망한 동물에게서 sampling을 실시하여, 선택배지에서 배양하는 것이 극복에 도움이 된다.

 

Health monitoring report

일반 실험 report와 HM report는 달라야 한다. 일반 실험 결과는 단순히 결과만을 반영하기 때문에, unit의 미생물학적인 상태를 반영하지 못한다. 전체 HM report에 대한 정보가 부족하기 때문이다.

HM보고서는 책임자에 의해 작성되어야 한다. 이들은 기관내 이해 당사자들이 동물이 오갈 때 사용 될 수 있도록 만들어져야 한다. HM 데이터는 실험작업의 일부이므로, 실험결과에 미치는 영향을 평가해야 하며, 논문에도 포함되어야 할 것이다.

HM report는 가능한한 표준화 되어야 한다. 만약에 병원체가 발견되고 확인된 경우에는 표기해야만 한다. 존재한다고 알려진 경우에는 더 이상 모니터링 할 필요는 없다. 감염된 unit은 재왕절개나 ET를 하기 전까진 계속 양성 결과가 나올것이기 때문이다.