세균의 영양분 대사와 증식, 호기성 세균 혐기성 세균, 3단분리 배양

세상에는 아주 많은 종류의 세균들이 존재한다. 이들의 대부분은 배양이 불가능하고, 대부분은 병원성이 없다. 그 이유는 숙주 체내의 환경이 세균이 번식할 알맞은 환경을 제공하지 못하기 때문이다. 그래서 우리가 마주하게 되는 병원성 미생물은 매우 소수에 불과하다. 그렇기 때문에 각 세균들이 어떠한 환경에서 자라는지에 대해서 연구하는 것은, 미생물에 대한 연구뿐만 아니라 환자의 치료에도 중요한 요소가 된다.

NUTRITIONAL CATEGORIES
미생물은 에너지를 사용하는 형태나 탄소 사용에 따라서 크게 2가지로 분류할 수 있다. Autotrophs (독립 영양체) 와 heterotrophs (종속 영양체)이다.

1. Autotrophs 독립 영양체 : 독립 영양체는 두 가지로 나뉘는데, 빛 에너지를 사용할 수 있는 phtosynthetic 한 독립 영양체와 무기 물질을 분해하는 화학반응을 이용하여 에너지를 합성하는 chemolithotrophic 한 독립 영양체이다. 이들은 영양분을 직접 합성하여 사용할 수 있으므로 동물에게서 특별한 병원성이 보고 된 바 없다.
2. Heterotrophs 종속 영양체 : 독립 영양체와 반대로 종속 영양체들은 빛이나 무기 물질을 영양분으로 쓸 수 없다. 번식에 필요한 탄소 영양분들은 환경에서 섭취되어야 한다. 그리고 세균마다 영양분으로 이용할 수 있는 유기 물질이 다르다. 따라서 종속 영양체들은 배양하기가 까다롭고, 현재까지 아주 적은 숫자의 세균만이 배양 가능하다고 알려져 있다.

Nutrient requirements
미생물에게 필요한 영양분은 크게 두 가지로 나뉠 수 있다. 살아가는데 필수적인 필수 영양소와 비필수 영양소이다. 필수 영양소는 미생물을 인공적으로 배양하기 위해 꼭 필요한 영양소들을 의미하기도 한다.
세포들은 에너지원으로 탄소를 꼭 필요로 한다. 그리고 질소, 인, 황, 나트륨, 칼륨, 철, 마그네슘, 망간 등을 필요로 한다. 이러한 요소들은 미생물이 자라나는 데 꼭 필요하다. 몇몇 미생물들은 앞서 말한 요소들만 있어도 배양이 가능한데 이들을 prototrophs라고 한다. (원영양체) 이들은 포도당, 암모늄, 인, 황과 같은 몇 가지 미네랄만 있으면 배양이 가능하다. 즉, 이들의 탄소원은 하나이다. 이러한 미생물들은 대사에 관하여 매우 복잡한 체계를 가지고 있다.
다른 미생물들은 복잡한 영양소 구성을 요구한다. 이들을 auxotrophs라고 한다. (영양 요구체) 예를 들면 일정 아미노산, 지방산, 핵산, 비타민들을 요구한다. 이들은 포도당과 같은 단당류를 이용하여 아미노산이나 지방산을 합성하지 못한다. 영양 요구도가 까다로운 것이 특징이다.
원 영양체처럼 모든 영양소를 단당류로부터 합성할 수 있는 세균이라고 할 지라도, 풍부한 영양소가 함유된 배지에선 더 빠르게 자라는 경향이 있다.

Hydrogen ion concentration
수소이온의 농도, 즉 산도에 따라 세균의 성장이 달라진다. 위에서 자라는 미생물의 경우에는 낮은 pH를 요구한다. (Helicobacter) 각각의 미생물은 자랄 수 있는 pH 범위가 다르다. 하지만 대부분 의학적으로 생명체에 영향을 끼치는 박테리아는 중성의 pH에서 자란다. (pH 7.0~7.5) pH는 미생물을 배양하는 동안 일정하게 유지되어야 하지만 자라나는 미생물들이 배출하는 유기 산으로 인해 pH가 낮아지기도 하고, 암모늄 이온을 배출하여 pH가 높아지기도 한다. 그래서 버퍼(buffer)를 집어넣어서 일정 pH를 유지하도록 한다.

Corbon dioxide concentration
모든 미생물들은 이산화탄소를 생존과 성장에 요구한다. 보통 지구의 대기에는 0.03%의 이산화탄소가 함유되어 있다. 그런데 몇몇 미생물들은 높은 이산화탄소 농도에서 빠르게 자라는 경향이 있어 CO2를 10% 주입하여 키우기도 한다.

Oxygen concentration
산소가 액체에 용해되어있는 경우 활성산소(radical)로써 독성이 매우 강하다. 산소를 대사 하다 보면 이러한 활성산소나 과산화수소가 생기기 때문에 이를 분해할 수 있는 대사 과정이 필요하다. 그런데 세균마다 이러한 산소를 대사 하는 능력이 다르기 때문에 산소 요구도가 달라지게 되며, 이러한 산소 요구도를 통하여 세균을 분류할 수 있다.

편성 호기성(obligate aerobes): 편성호기성 세균은 산소 존재하에서만 자라나는 세균이다. 편성 호기성의 병원성 미생물은 잘 없지만, 상부 기도에 병을 일으키는 세균이 간혹 있다.
통성혐기성(facultative anaerobes): 통성혐기성 세균은 산소가 존재해도 살 수 있고, 존재하지 않아도 살 수 있으나 산소가 존재하면 더 잘 자라는 세균들을 일컫는다. 대부분의 세균이 여기에 속하고, 대부분의 병원성 세균 또한 여기에 속한다. 산소를 지속적으로 공급해주면 잘 자라지만, 산소가 유입되지 않아도 느리긴 하지만 자란다. 실험실에서 배양할 땐 대부분 호기적인 환경을 제공해주는 편이다. 산소가 없어도 대사 하는 '발효'과정과 '호흡성 대사'(repiratory metabolism)을 둘 다 할 수 있는 세균들이다.
미호기성(microaerophiles): 산소를 필요로는 하지만, 보통 대기에 존재하는 산소보다 적은 양의 산소를 요구하는 경우이다. Brucella, actinomyces, Campylobacter와 같은 세균들이 여기에 속한다. 6%의 산소를 포함하는 환경에서 자라며, 실험실에서는 반고체(0.1~0.4%) 형의 한천 배지에서 키운다.
편성 혐기성(obligate anaerobes): 편성 혐기성세균은 산소가 있는 환경에서 자라지 못한다. 즉 적은양의 산소만 있어도 독성이 있다. 건강한 동물들에게서 편성혐기성 세균은 구강(이와 잇몸사이)과 장내에서 발견된다. 대부분의 감염은 통성혐기성세균과 편성혐기성 세균에 의해서 시작되었다가, 통성혐기성 세균에 의해서 산소가 빠르게 소실되고 그 환경에서 편성혐기성 세균이 더욱 증식하는 형태이다. Clostridium, Fusobacterium 등의 세균이 여기에 속한다.

Temperature
온도는 세균이 자라기 위한 중요한 요건중 하나이다. 추운 환경에서는 대사 속도가 느려져서 세균은 오랫동안 생존할 수 있다. 온도가 증가하면서 대사 속도가 빨라져서 성장 속도도 빨라지게 된다. 최대한의 성장 속도를 만들어내는 온도를 넘어서게 되면 단백질과 핵산이 비가역적으로 변성되어서 성장 속도는 가파르게 감소한다.
포유류에 감염되는 대부분의 병원성 미생물의 경우 최적으로 성장할 수 있는 온도는 포유류의 체온에 가까운 35도에서 37도이다. 하지만 몇몇 세균들은 더 낮은 온도에서 자라기도 한다. (Yersinia species) 이들은 중온균(mesophiles)라고 한다. 신체에서 염증이 일어나는 경우 발열 또한 일어난다. 체온이 올라가게 되면 미생물이 자랄 수 없는 환경이 되기 때문에 미생물의 감염을 줄일 수 있다.
온도가 증가함에 따라서 미생물은 사멸하게 된다. 이 원리를 이용하여서 우리는 '살균'과 '멸균'을 하게 된다. 이때 살균은 병원성 미생물이 없는 상태를 의미하며 멸균은 살아있는 미생물이 없는 상태를 의미한다. 온도가 내려가는 것도 중요한 영향을 끼친다. 온도가 내려갈수록 대사 속도가 떨어져 미생물의 성장이 더뎌진다. 그런데 온도가 올라가는 것과 달리 온도가 내려가는 것은 성장 속도에 영향을 미칠 뿐, 사멸시키지는 못한다. 그래서 미생물을 보관할 땐 낮은 온도에서 보관하는 방법을 사용한다.

MOVEMENT OF NUTRIENTS INTO CELLS
movebment through the capsule and cell wall
미생물을 감싸고 있는 capsule은 느슨하게 구성되어 있어서 수용성의 물질들은 모두 확산될 수 있다. 하지만 colloid 크기의 물질은 통과하지 못한다.
그람 양성 세균의 세포벽은 확산이 가능하지만 딱딱한 세포벽으로 구성되어 있어 수용성 영양분만이 확산하여 통과할 수 있다. 반대로 그람음성 세균의 세포벽은 확산이 불가능하여 porin이라는 단백질을 통해 이동하게 된다.
translocation across the plasma membrane
미생물은 무기 이온이 녹아있는 액체 배지에서 가장 잘 자라는 경향이 있다. 그리고 대부분의 미생물들은 환원된 유기 물질을 에너지원으로 사용한다. 영양소를 사용하기 위해서 영양소는 세포막을 통과해야 한다. ATP사용 없이 통과하는 확산, ATP를 사용하는 능동 수송을 이용하여 영양소는 세포 안으로 들어가게 된다.
passive and facilitated diffusion
수동 확산은 물질이 세포안으로 들어가는데 있어서 가장 간단한 방법이다. 수송 단백질이나 에너지 소요 없이 그냥 투과하여 세포 안으로 들어가는 방식이다. 하지만 수동확산은 느리며 막 사이의 두 공간의 농도가 같아질 경우에는 더 이상의 농도 변화는 일어나지 않는다. (농도가 짙은 곳에서 옅은 곳으로 확산하지만 농도가 같아지만 더이상의 농도 변화가 일어나지 않는다.)
촉진 확산은 수동확산과 에너지가 들지 않는다는 점에서 수동확산과 비슷하지만 세포막의 carrier protein을 이용하여 확산된다는 점이 다르다. 따라서 수동확산에 비해서 빠르게 일어난다. 촉진확산은 미생물에게서 잘 관찰되지 않는 방식이기도 하다. E.coli가 Glycerol을 이용할 때 촉진 확산을 사용한다.
Coupled transport
능동 수송의 일종인 짝지은수송, 공역수송은 에너지를 사용하여 바깥쪽에서 안쪽으로(대부분은) 물질을 이동시키는 수송방식이다. 공역수송은 세포막 단백질의 일종인 permeases를 필요로 한다. 확산 방식과 마찬가지로 공역수송은 이동하는 물질에 상태변화 없이 그대로 이동시킨다.

Group translocation
능동수송의 일종인 집단 전위는 에너지를 사용하여 물질을 이동시키며 세포막 단백질과 에너지를 필요로 한다. 집단 전위를 통하여 들어오는 영양소는 화학적으로 변화하여 들어오는데, 인산기가(-P) 붙는 것이 일반적이다. 원핵세포에서 많이 일어나는 수송 방식이다

ESTABLISHMENT AND GROWTH OF PURE CULTURE
Pure culture isolation
내가 원하는 미생물만을 순수 배양하는 것은 미생물을 연구하고 진단하는 데 있어서 필수적인 요소이다. 분리 배양을 하기 위해선 고형배지 위에서 물리적으로 세균을 분리시켜 순수배양을 한다. 미생물을 키우기 위해 제조한 물질을 '배지'라고 하며 이는 선택 배지와 영양 배지로 나뉜다.

 

분리배양, 순수배양을 위해서 가장 흔하게 사용되는 방법은 고체 배지 위에서의 3단분리 배양이다. 표적된 균의 독립 집단을 분리하는 방법으로 분리된 하나의 colony는 동일한 균으로 구성되어 있다.

3단분리 하는 법

Selective and differential media
이상적인 선택 배지는 내가 원하는 세균 하나만 키우는 배지이다. 선택 배지를 만들기 위해서 경쟁 세균을 억제하는 항생물질을 넣거나, 세균의 대사로 인하여 번화하는 pH를 감지하기 위한 염료를 넣거나, 비누, 소금 등을 넣어 만든다.
분별 배지는 여러 종류의 세균이 자라기는 하지만, 세균마다 그 특성이 다르게 나타나는 배지로 혈액 한천 배지가 대표적이다. 혈액 한천 배지는 용혈 여부에 따라서 자라나는 세균을 구분할 수 있다. α용혈의 경우에는 불완전 용혈로 세균 주변이 초록색으로 변하는 것이 특징이며 β용혈의 경우에는 완전 용혈로 세균 주변이 투명하게 변한다.

혈액한천배지 위에서 자란 S.aureus, 완전용혈인 베타용혈이 관찰된다. 해당 세균을 순수 분리배양 하기 위해서 고체배지에서의 3단 분리법이 사용되었다.

MacConkey 배지, 맥콩키 배지 또한 대표적인 분별 배지로 그람 음성 세균을 키우는 배지이다. lactose가 함유되어 있고, 그람 양성균은 크리스털 바이올렛이 함유되어 있어 성장이 억제된다. lactose를 발효하는지의 여부에 따라 pH가 달라져 색상의 차이가 일어난다.
이러한 선택 배지나 분별 배지는 고체 배지가 대부분이다. 그래서 키우고자 하는 세균의 수가 적거나, 더 많은 양을 키우고자 할 때는 영양 배지를 사용하여 배양해야 한다.

Enrichment culture
적은 양의 미생물을 배양하거나 모든 세균을 키우고자 할 때 사용된다. 액체 배지가 대부분 사용된다.

Bacterial growth chracteristics
세균이 자라기 위해선 최소한의 필수 영양소와, 적합한 산소농도, 적합한 온도가 필요하다. 세균을 키우는 배지의 영양분이 고갈되면 세균은 더 이상 자라지 못한다. 이를 그래프로 표현하면 다음과 같다.

 lag phase, 유도기 에선 세균들은 세포 분열에 필요한 핵산과 단백질을 합성한다.
loge phase 대수기, 지수 증식기에선 세포 분열이 활발하게 일어난다.
stationary phase 정지기에선 세균이 증식하긴 하지만 죽는 숫자도 일정하여 세균의 총숫자에는 증감이 없다.
death phase 사멸기에선 세균이 사멸한다.

고체배지에서도 똑같은 방식으로 세균이 증식하고 사멸한다. 하지만 액체배지에서와 달리 고체배지 위에선 세균 간의 거리가 좁은 편이기 때문에 영양분이 빠르게 고갈되는 편이다. 따라서 세균 콜로니 가운데서부터 정지기와 사멸기가 나타난다.